Wysokosprawna chromatografia cieczowa

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Przejdź do nawigacji Przejdź do wyszukiwania
HPLC

Wysokosprawna chromatografia cieczowa, HPLC (ang. high-performance liquid chromatography) – odmiana chromatografii cieczowej, technika analityczna a także preparatywna, stosowana do oczyszczania, badania czystości oraz identyfikacji związków chemicznych.

Spektrofotometria – technika pomiarowa polegająca na ilościowym pomiarze transmisji lub odbicia światła przez próbkę. Od połowy XX wieku stanowi główne narzędzie spektroskopii absorpcyjnej i odbiciowej w bliskim nadfiolecie i świetle widzialnym, a dawniej również w podczerwieni, znajdując szerokie zastosowanie w chemii analitycznej, biologii, medycynie i badaniach materiałowych.Heksan (C6H14) – organiczny związek chemiczny z grupy alkanów. Izomery heksanu są bardzo niereaktywne oraz są często stosowane jako rozpuszczalniki w reakcjach organicznych, ponieważ są wysoce niepolarne. Wchodzą również w skład benzyn.

Jest to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Oznacza to, że analizowana próbka jest rozpuszczana w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku, zależnym od właściwości substancji i zastosowanego układu, a następnie taki roztwór jest kierowany na kolumnę, która wypełniona jest odpowiednio dobranym złożem porowatym lub żelowym. Rolę cieczy nośnej (fazy ruchomej) pełni odpowiednio dobrana mieszanina (tzw. eluent). Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi będącymi składnikami analizowanej próbki a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdział. W zależności od zastosowanego układu można wyróżnić kilka mechanizmów retencji, np. te związki chemiczne, które silniej oddziałują ze złożem (mają tzw. większe powinowactwo do złoża) a słabiej z fazą ruchomą, przepływają wolniej przez kolumnę, zaś związki chemiczne, które oddziałują słabiej ze złożem a silniej z fazą ruchomą przepływają szybciej. W pewnych specyficznych układach HPLC mechanizmy retencji są jednak bardziej złożone.

Preparatyka chemiczna – dział chemii, obejmujący szczegółowe opisy metod laboratoryjnego otrzymywania związków chemicznych lub preparatów chemicznych (mieszanin związków), w tym opisy wykorzystywanych reakcji chemicznych, np. (syntez organicznych, stosowanej aparatury laboratoryjnej, metod wyodrębniania pożądanych produktów z mieszanin z nieprzereagowanymi substratami oraz ich oczyszczania (np. adsorpcja, chromatografia preparatywna, ekstrakcja, destylacja, destylacja z parą wodną, krystalizacja i rekrystalizacja, resublimacja).Termostat – urządzenie lub element urządzenia utrzymujący ("-stat") zadaną temperaturę ("termo-") poprzez aktywne działanie. Czasami nazwa rozciągana jest też na urządzenia o charakterze biernym utrzymujące temperaturę dzięki dobrej izolacji cieplnej np. termos lub naczynie Dewara lub wykorzystujące zjawiska przebiegające w określonych temperaturach np. łaźnia wodna.

HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim podawany jest eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, kilkadziesiąt atm, w części przypadków przekraczające 100 atm. Wysokie ciśnienie w układzie HPLC wynika z budowy pomp HPLC (wąskie przekroje kapilar), uziarnienia wypełnienia kolumn (kilka mikrometrów) i przepływu fazy ruchomej stosowanego w aplikacji(od ułamków ml/min do nawet kilkudziesięciu ml/min w przypadku chromatografii preparatywnej). Drobne uziarnienia złoża fazy stacjonarnej skutkuje korzystniejszymi parametrami sprawności i rozdzielczości układu HPLC, dzięki czemu uzyskujemy rozdział analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne w znacznie krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu eluentu i mniejszej ilości analizowanej próbki niż w klasycznej chromatografii kolumnowej. Zdolności rozdzielcze współczesnych aparatów i kolumn HPLC są niekiedy porównywalne do zdolności rozdzielczych chromatografii gazowej.

Fluorescencja – jeden z rodzajów luminescencji – zjawiska emitowania światła przez wzbudzony atom lub cząsteczkę. Zjawisko uznaje się za fluorescencję, gdy po zaniku czynnika pobudzającego następuje szybki zanik emisji w czasie około 10 s. Gdy czas zaniku jest znacznie dłuższy, to zjawisko jest uznawane za fosforescencję.Silikażel, żel krzemionkowy - kserożel utworzony z uwodnionych cząstek krzemionki (czyli dwutlenku krzemu). Jego kształt, oraz porowata struktura, pozostają niezmienione nawet po całkowitym wysuszeniu tworząc olbrzymią powierzchnię, dzięki czemu silikażel posiada własności rozdzielcze i osuszające. Zastosowanie: chromatografia jako faza stacjonarna, desykant, a także jako wypełniacz w przemyśle gumowym, oraz nośnik katalizatorów.

W HPLC duże znaczenie dla rozdziału ma polarność faz. Początkowo stosowano normalny układ faz (NP, normal phase), w którym faza stacjonarna jest znacznie bardziej polarna niż faza ruchoma (Np. układ: żel krzemionkowyheksan). Obecnie najczęściej stosuje się odwrócony układ faz (RP, reverse phase – układ faz odwróconych), w którym faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma, np. układ: żel krzemionkowy z chemicznie modyfikowaną powierzchnią (grupy oktadecylosilanowe, oktylosilanowe, diole, podstawniki modyfikowane i inne, bardziej złożone) – mieszanina metanolu, acetonitrylu, wody, specjalnie dobranych buforów itp. Podział zależy od wiązania się hydrofobowych cząsteczek substancji rozpuszczonej z fazy ruchomej do unieruchomionych, hydrofobowych ligandów związanych z fazą stacjonarną. Siła i charakter oddziaływania między cząsteczkami próbki i fazą stacjonarną zależy zarówno od oddziaływań hydrofobowych, jak i oddziaływań polarnych. Substancje rozpuszczone są wymywane w kolejności rosnącej molekularnej hydrofobowości. Układy RP mają bardziej trwałe wypełnienia, cechują się niższym kosztem fazy ruchomej, a przede wszystkim cechują się inną selektywnością niż układy NP, co wykorzystuje się w analizie próbek o dużej rozpiętości polarności komponentów.

Tetrahydrofuran (THF) (nazwa systematyczna – oksolan) to organiczny związek chemiczny z grupy eterów cyklicznych, będący pochodną furanu, stosowany głównie jako uniwersalny rozpuszczalnik organiczny. Jego dawna nazwa to czterowodorofuran.Amperometria – technika analityczna, bazująca na pomiarze zależności natężenia prądu od stężenia substancji elektroaktywnej przy stałym potencjale. Stosuje się układ elektrody pracującej i odniesienia zanurzonych w badanym roztworze składającym się z elektrolitu i badanej substancji.

Aparatura chromatograficzna[ | edytuj kod]

Aparaty HPLC składają się zwykle z:

  • zbiornika na eluenty, bufory, odpowiednie roztwory płuczące itp.;
  • automatycznego odgazowywacza, który usuwa gazy rozpuszczone w eluentach (przy chromatografii gradientowej po zmieszaniu składników często następuje samorzutne odgazowanie, przez co w strumieniu eluentu pojawiają się pęcherzyki powietrza mogące silnie zakłócać proces rozdziału na kolumnie i detekcji wymywanych składników);
  • zaworów proporcjonujących, w których faza ruchoma osiąga zadany skład, co ma szczególne znaczenie w analizach gradientowych (tzw. gradient niskociśnieniowy, gdyż mieszanie składników eluentu następuje przed pompą, czyli w obszarze niskiego ciśnienia). Drugim typem jest tzw. gradient wysokociśnieniowy, gdzie najczęściej stosuje się dwie identyczne pompy dla obu mieszanych składników eluentu (obie pompy zintegrowane są w jednej obudowie), mieszanie następuje za pompami, czyli w obszarze wysokiego ciśnienia. Układ z zaworami proporcjonującymi zazwyczaj umożliwia mieszanie większej ilości roztworów (najczęściej 4, podczas gdy układ wysokociśnieniowy najczęściej 2), natomiast układ wysokociśnieniowy umożliwia znacznie szybszą zmianę składu eluentu (dzięki znacznie mniejszej objętości układu między mieszaczem a kolumną);
  • pomp zapewniających odpowiednie parametry przepływu eluentu w układzie. Pompa zazwyczaj zintegrowana jest w jednej obudowie z mieszaczem (wspomniany wcześniej układ nisko lub wysokociśnieniowy);
  • nastrzykiwacza (iniektora) umożliwiającego wprowadzanie analizowanych próbek bez rozszczelnienia układu (często próbnik automatyczny (autosampler));
  • odpowiednich filtrów, jeśli aplikacja tego wymaga;
  • prekolumny usuwającej z eluentu zanieczyszczenia mechaniczne, które mogłyby zniszczyć wypełnienie kolumn (najczęściej stosuje się wypełnienie identyczne lub porównywalne z właściwą kolumną do rozdziału);
  • kolumny (kolumn) z odpowiednim wypełnieniem, takim jak:
  • żel krzemionkowy lub jego modyfikację polarnymi grupami (faza normalna, NP);
  • żel krzemionkowy modyfikowany grupami o niskiej polarności (faza odwrócona, RP), najczęściej grupami oktadecylowymi, C18;
  • wypełnienia polimerowe – bardzo odporne chemicznie, umożliwiają prace w całym zakresie pH, ale ustępujące jak na razie możliwościom rozdzielczym wypełnień opartych na żelu krzemionkowym;
  • termostatu kolumn (pracującego w zakresie najczęściej od 5 do 80 °C);
  • detektora – którym może być przepływowy spektrofotometr UV-VIS lub fluorescencyjny, spektrometr mas, laserowy spektrometr rozproszeniowy lub amperometr;
  • zbiornika na zużyty eluent lub – w przypadku aparatów preparatywnych – kolektora frakcji (systemu naczyń zmienianych automatycznie po upływie zadanego czasu lub sterowanego sygnałami z detektora).
  • Chromatogram złożonej mieszaniny (perfumy) otrzymany techniką HPLC

    W typowym, analitycznym aparacie HPLC analiza jednej próbki trwa od kilku do kilkudziesięciu minut. Kolumny HPLC mają przeciętnie długość od 3 do 25 cm (bywają jednak kolumny o długości 30 cm lub większej) i przekrój wewnętrzny rzędu kilku milimetrów i mogą być czasem zestawiane w układy o określonej zdolności rozdzielczej. W czasie jednej analizy zużywa się od kilku do kilkudziesięciu mililitrów eluentu. Jako eluent stosuje się rozmaite rozpuszczalniki organiczne (metanol, chlorek metylenu, THF, toluen, etanol, acetonitryl, rozmaite bufory i inne). Analizowana próbka ma zwykle objętość od 1 do 200 µl w analitycznej HPLC, a w preparatywnej do kilkudziesięciu mililitrów.

    Chlorek metylenu (nazwa systematyczna: dichlorometan, CH2Cl2) – organiczny związek chemiczny z grupy halogenków alkilu; chlorowa pochodna metanu. W temperaturze pokojowej, przy ciśnieniu atmosferycznym, jest bezbarwną, szybko parującą cieczą. Posiada charakterystyczny, słodkawy zapach.Analiza chemiczna – badanie jakościowego (analiza jakościowa) i ilościowego (analiza ilościowa) składu chemicznego substancji.


    Podstrony: 1 [2] [3]




    Warto wiedzieć że... beta

    Chromatografia gazowa (ang. Gas chromatography, GC) - technika analityczna chromatograficzna, w której fazą ruchomą jest gaz (najczęściej hel, argon, azot wysokiej czystości, coraz rzadziej wodór), a fazą stacjonarną adsorbent lub absorbent, pokrywający nośnik (wypełnienie kolumny lub jej ścianki). Technika GC umożliwia ustalenie procentowego składu mieszanin związków chemicznych, w których występuje ich nawet kilkaset. Stosując klasyczną detekcję (np. z użyciem katarometrów) można dokonać orientacyjnej identyfikacji składników mieszaniny na podstawie ich czasów retencji. Niemal jednoznaczną identyfikację umożliwia użycie spektrometru mas jako detektora (Gas chromatography - mass spectrometry, GC-MS).
    Półka teoretyczna (stopień teoretyczny) – hipotetyczna przestrzeń takich instalacji, jak np. kolumny rektyfikacyjne, chromatograficzne, ekstrakcyjne, adsorpcyjne lub absorpcyjne, która charakteryzuje się określonym stanem równowagi termodynamicznej, ustalonym między fazami (np. ciecz i para, gaz i faza stała, dwie nie mieszające się ciecze).
    Chromatografia cieczowa, LC (ang. Liquid Chromatography) − stosowana w chemii metoda preparatywna, a także analityczna. W chromatograii tej eluentem jest ciecz (zwykle jakiś rozpuszczalnik). Istotą każdej chromatografii cieczowej jest rozdział analizowanej mieszaniny na poszczególne związki chemiczne poprzez przepuszczanie roztworu tej mieszaniny przez stałe lub żelowe złoża, podobnie jak w procesie sączenia. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami tworzącymi mieszaninę i złożem, jedne z nich przechodzą przez złoże szybciej, a inne wolniej.
    Polarność – właściwość indywiduów chemicznych polegająca na występowaniu w nich elektrycznego momentu dipolowego w wyniku nierównomiernego rozłożenia cząstkowych ładunków elektrycznych w ich objętości.
    Detektor - urządzenie służące do wykrywania (detekcji) i ewentualnie rejestracji . Detekcji podlegać mogą różne obiekty, zjawiska i parametry fizyczne Detektory stosuje się wówczas, gdy badany sygnał nie możne być zarejestrowany bezpośrednio zmysłami człowieka lub wówczas, gdy działa jako element urządzenia automatycznie reagującego na nadejście sygnału oraz wtedy, gdy pożądana jest bezobsługowa rejestracja sygnałów. Detektor zamienia wykrywany sygnał na formę możliwą do obserwacji lub rejestracji.
    Rozpuszczalnik − ciecz zdolna do tworzenia roztworu po zmieszaniu z ciałem stałym, inną cieczą lub gazem. Najbardziej znanym rozpuszczalnikiem jest woda.
    Atmosfera fizyczna (atmosfera normalna, atm) – pozaukładowa jednostka miary ciśnienia, równa ciśnieniu 760 milimetrów słupa rtęci (mmHg) w temperaturze 273,15 K (0 °C), przy normalnym przyspieszeniu ziemskim.

    Reklama