• Artykuły
  • Forum
  • Ciekawostki
  • Encyklopedia
  • Western blot

    Przeczytaj także...
    Przeciwciała, immunoglobuliny – rodzaj białek wydzielanych przez komórki plazmatyczne (czyli pobudzone limfocyty B) w przebiegu odpowiedzi odpornościowej typu humoralnego. Charakteryzują się one zdolnością do swoistego rozpoznawania antygenów.Denaturacja białka – zmiany w II, III- i IV-rzędowej strukturze białka natywnego, które prowadzą do utraty aktywności biologicznej lub innej indywidualnej cechy charakterystycznej przy zachowaniu sekwencji aminokwasów.
    Nitroceluloza – mieszanina estrów celulozy i kwasu azotowego(V) – azotanów(V) celulozy, jej ogólny wzór sumaryczny to: [C6H7O2(ONO2)3]n. Do każdej reszty glukozowej dołączone są grupy –NO2 (od jednej do trzech, w zależności od stopnia znitrowania), pochodzące od kwasu azotowego. Maksymalna zawartość azotu w nitrocelulozie wynosi teoretycznie 14,14% (w praktyce zwykle mniej).
    Przykładowy western blot – ekspozycja na kliszy fotograficznej z wykorzystaniem drugorzędowych przeciwciał skoniugowanych z peroksydazą chrzanową katalizującą reakcję luminescencyjną.
    Diagram prezentujący metodę western blot

    Western blot – stosowana w biologii molekularnej metoda służąca do wykrywania określonych białek.

    Epitop lub determinanta antygenowa – fragment antygenu, który łączy się bezpośrednio z wolnym przeciwciałem, receptorem limfocytów B lub receptorem limfocytów T wiążących antygen.Żelatyna (gelatin, ATC: B 05 AA 06) – prześwitujące, bezbarwne ciało stałe, naturalna substancja, będąca mieszaniną białek i peptydów, pozyskiwana w drodze częściowej hydrolizy kolagenu, zawartego w skórze, chrząstkach i kościach zwierzęcych. Składa się z glicyny, proliny i hydroksyproliny. Rozpuszczona w wodzie tworzy układ koloidalny – zol liofilowy, który łatwo przechodzi w żel, o ile temperatura otoczenia nie jest zbyt wysoka.

    Metodą tą rozdziela się zdenaturowane białka według ich mas oraz naturalne (niezdenaturowane) białka według ich struktury przestrzennej, za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Później białka są przenoszone na membranę (zwykle nitrocelulozową lub PVDF). Obecność odpowiednich białek sprawdza się za pomocą barwników – którymi mogą być pąs S (ponceau S), czerń amidowa lub błękit brylantowy Coomassie (Coomassie brilliant blue), zwany kumazyną – albo przeciwciał przyłączających się do ich epitopów.

    Mleko w proszku – przetwór mleczny uzyskiwany przez odparowanie z pełnego, znormalizowanego lub chudego (odtłuszczonego) mleka krowiego prawie całej wody (pozostałość wody w proszku mlecznym to ok. 2%). Technologia produkcji mleka w proszku została opracowana w 1855 roku.Biologia molekularna – nauka podstawowa zajmująca się biologią na poziomie molekularnym. Bada, w jaki sposób funkcjonowanie organizmów żywych uwarunkowane jest właściwościami budujących je cząsteczek, a zwłaszcza biopolimerów, jakimi są kwasy nukleinowe i białka. Zazębia się ona z takimi dziedzinami wiedzy jak genetyka, biochemia, biofizyka czy cytologia.

    Przed dodaniem przeciwciał membrana zostaje „zablokowana” przez zanurzenie w roztworze innego białka, zwykle żelatyny, albuminy surowicy krwi bydlęcej (BSA) lub odtłuszczonego mleka w proszku, często z dodatkiem detergentu (np. Tween 20) lub w roztworze samego detergentu, w celu uniemożliwienia niespecyficznego łączenia się przeciwciał z membraną.

    Wirus zapalenia wątroby typu C (WZW C, ang. hepatitis C virus, HCV) – otoczkowy ssRNA-wirus z rodziny Flaviviridae, rodzaju Hepacivirus. Jego średnica wynosi około 60–70 nm.Surowica krwi – produkt krzepnięcia krwi i retrakcji (rozpuszczania) skrzepu. Jej skład różni się znacząco od składu osocza. Płynna frakcja krwi pozbawiona krwinek, płytek krwi oraz fibrynogenu i czynników krzepnięcia (w przeciwieństwie do osocza surowica krwi nie krzepnie), w jej skład wchodzą natomiast rozpuszczalne produkty konwersji fibrynogenu w fibrynę oraz składniki uwalniane z płytek krwi. Nie można zatem powiedzieć, że w skład krwi wchodzi m.in. osocze, a w skład osocza m.in. surowica.

    Analogicznie do metody ELISA w metodzie western blot można używać jednego przeciwciała związanego ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub dwóch rodzajów przeciwciał: nieznakowanego, przeciwko wykrywanemu białku (przeciwciała pierwszorzędowe) oraz znakowanego, przeciwko danemu izotypowi immunoglobulin (przeciwciała drugorzędowe; metoda pośrednia).

    Poli(fluorek winylidenu) (polifluorek winylidenu; PVDF, z ang. polyvinylidene fluoride) – termoplastyczny polimer fluorowy o wysokim stopniu krystalizacji.PVDF łączy dobre własności mechaniczne, cieplne i elektryczne z wysoką odpornością chemiczną. Używany do produkcji m.in. membran do mikrofiltracji i ultrafiltracji.Peroksydaza chrzanowa (ang. horseradish peroxidase, HRP) – enzym zawarty m.in. w chrzanie pospolitym, znajdujący szerokie zastosowanie w biologii molekularnej. Jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej 44 kDa, zawierającą cztery reszty lizynowe. Podobnie jak inne peroksydazy zawiera cząsteczkę hemu jako koenzym. W neurohistologii HRP stosowana jest do badania transportu aksonalnego. W zależności od użytego substratu efektem katalizowanej reakcji może być barwny, fluoryzujący, lub chemiluminescencyjny produkt, dzięki czemu staje się on łatwy do wykrycia. HRP Stosuje się powszechnie po koniugacji z przeciwciałem drugorzędowym w technikach ELISA i Western blot.

    Przeciwciała są znakowane zwykle enzymem (np. peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną), fluorochromem lub izotopem radioaktywnym. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję. W przypadku wizualizacji przez luminescencję lub izotopy obraz otrzymuje się przez przyłożenie membrany do kliszy fotograficznej.

    Fosfataza alkaliczna (fosfataza zasadowa, Numer EC 3.1.3.1 w bazie Enzyme nomenclature database) – enzym z klasy hydrolaz o aktywności fosfatazy. Jej rola polega głównie na katalizowaniu defosforylacji różnych estrów fosforanowych. Optymalnie działa w środowisku zasadowym.Albuminy – białka występujące w płynach (np. osoczu krwi i mleku) oraz w tkankach zwierzęcych i w nasionach roślin. Cechują się niewielkimi masami cząsteczkowymi, dobrze rozpuszczają się w wodzie (są hydrofilowe), łatwo krystalizują. W składzie istotną rolę odgrywa kwas asparaginowy i glutaminowy (do 25%), leucyna i izoleucyna (ok. 16%), natomiast glicyny jest niewiele (ok. 1%).

    W diagnostyce wirusowego zapalenia wątroby typu C metodą tą wykrywa się rdzeń wirusa.

    Przypisy

    1. Jakub Barylski: Technika Western blot i jej zastosowanie w diagnostyce. [dostęp 2011-10-14].
    2. Jeremy Mark Berg, John L Tymoczko, Lubert Stryer: Biochemia. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2005, s. 103. ISBN 83-01-14379-7.



    w oparciu o Wikipedię (licencja GFDL, CC-BY-SA 3.0, autorzy, historia, edycja)

    Warto wiedzieć że... beta

    Wirusowe zapalenie wątroby typu C (WZW C) – choroba zakaźna spowodowana przez wirusa zapalenia wątroby typu C zajmująca głównie wątrobę. WZW C często przebiega bezobjawowo, ale jego przewlekła postać może prowadzić do marskości wątroby. W niektórych przypadkach osoby chore na marskość wątroby cierpią także z powodu niewydolności wątroby, raka wątroby, a także żylaków przełyku i żołądka.
    ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay), czyli test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorbcyjny – jeden z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych. Służy on do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych skoniugowanych z odpowiednim enzymem. W podstawowej wersji testu ELISA, pewna ilość antygenu unieruchomiona jest na powierzchni fazy stałej. Wykonanie testu polega na wprowadzeniu materiału biologicznego zawierającego przeciwciała specyficzne dla unieruchomionego antygenu. Przeciwciała te powinny być uprzednio połączone wiązaniem kowalencyjnym z enzymem. Unieruchomiony antygen i specyficzne przeciwciało tworzą kompleks immunologiczny, dzięki któremu przeciwciało zostaje trwale związane z podłożem. Po przepłukaniu środowiska reakcji i dodaniu odpowiedniego substratu, enzym związany ze specyficznym przeciwciałem katalizuje reakcję, której produkt (najczęściej barwny) można oznaczyć spektrofotometrycznie. Należy jednak zdawać sobie sprawę z faktu, że przedstawiony powyżej opis działania metody jest silnie uproszczony i może podlegać wielu modyfikacjom, a najważniejsze z nich przedstawiono w dalszej części artykułu.

    Reklama

    Czas generowania strony: 0.03 sek.