• Artykuły
  • Forum
  • Ciekawostki
  • Encyklopedia
  • Izolacja RNA



    Podstrony: 1 [2] [3]
    Przeczytaj także...
    Rybonukleazy (RNazy) to enzymy z klasy hydrolaz (podklasa nukleazy) dzielące cząsteczki RNA na krótsze łańcuchy lub pojedyncze nukleotydy przez hydrolizę wiązań fosfodiestrowych.Długość fali – najmniejsza odległość pomiędzy dwoma punktami o tej samej fazie drgań (czyli pomiędzy dwoma powtarzającymi się fragmentami fali – zob. rysunek). Dwa punkty fali są w tej samej fazie, jeżeli wychylenie w obu punktach jest takie samo i oba znajdują się na etapie wzrostu (lub zmniejszania się). Jeżeli w jednym punkcie wychylenie zwiększa się a w drugim maleje, to punkty te znajdują się w fazach przeciwnych.

    Izolacja RNA – proces oczyszczania RNA z innych składników obecnych w komórce. Wyizolowany RNA może zostać użyty m.in. do analizy ekspresji genów, poznania ich budowy (np. lokalizacja egzonów i intronów), kompletowania bibliotek cDNA.

    RNA jest bardzo wrażliwy na rozkład przez rybonukleazy, enzymy należące do nukleaz, przecinające wiązanie fosfodiestrowe w szkielecie cukrowo-fosforanowym RNA. Rybonukleazy występują powszechnie i cechuje je bardzo duża stabilność – mogą one zachowywać aktywność nawet po autoklawowaniu. Z tej przyczyny podczas pracy z RNA należy zachować dużą staranność, aby nie dopuścić do przedostania się rybonukleaz do próbek (podczas pracy z DNA ryzyko degradacji, zarówno chemicznej, jak i enzymatycznej, jest znacznie mniejsze). Podstawowym wymogiem jest stosowanie rękawiczek jednorazowych, chroniących preparaty przed rybonukleazami z powierzchni skóry. Poza tym dobrą praktyką jest używanie osobnego kompletu materiałów (np. pipet) z przeznaczeniem tylko do badań RNA. Do inaktywacji rybonukleaz na sprzęcie laboratoryjnym, jak też do sporządzania wody wolnej od rybonukleaz, wykorzystuje się diwęglan dietylu (pirowęglan dietylu).

    Chloroform (łac. chloroformium) – organiczny związek chemiczny z grupy halogenoalkanów, chlorowa pochodna metanu. Błona komórkowa, plazmolema, plazmolemma (cytolemma, plasmolemma) – półprzepuszczalna błona biologiczna oddzielająca wnętrze komórki od świata zewnętrznego. Jest ona złożona z dwóch warstw fosfolipidów oraz białek, z których niektóre są luźno związane z powierzchnią błony (białka peryferyjne), a inne przebijają błonę lub są w niej mocno osadzone białkowym lub niebiałkowym motywem (białka błonowe).

    Komórka eukariotyczna zwykle zawiera ok. 10–30 pg całkowitego RNA, z czego 80–85% stanowi rRNA. mRNA stanowi w zależności od typu i stanu metabolicznego komórki ok. 1–5% całkowitego RNA komórki.

    Metody izolacji RNA[ | edytuj kod]

    Procedury izolacji RNA podobne są do izolacji DNA. Opierają się one na lizie i homogenizacji komórek w środowisku, w którym rybonukleazy są szybko denaturowane. Następnie przeprowadza się ekstrakcję fenolowo-chloroformową i precypitację. W ten sposób otrzymuje się całkowity RNA komórki. Można je wykorzystać bezpośrednio do dalszych doświadczeń lub poddać rozdziałowi na różne frakcje. W celu dalszego oczyszczenia surowego preparatu RNA stosuje się deoksyrybonukleazy trawiące pozostałości DNA, a resztki białek można usunąć przez stosowanie proteaz (np. proteinazę K).

    Denaturacja białka – zmiany w II, III- i IV-rzędowej strukturze białka natywnego, które prowadzą do utraty aktywności biologicznej lub innej indywidualnej cechy charakterystycznej przy zachowaniu sekwencji aminokwasów.Spektrofotometria – technika pomiarowa polegająca na ilościowym pomiarze transmisji lub odbicia światła przez próbkę. Od połowy XX wieku stanowi główne narzędzie spektroskopii absorpcyjnej i odbiciowej w bliskim nadfiolecie i świetle widzialnym, a dawniej również w podczerwieni, znajdując szerokie zastosowanie w chemii analitycznej, biologii, medycynie i badaniach materiałowych.

    Uzyskany preparat może zawierać śladowe ilości rybonukleaz, dlatego nie nadaje się do długiego przechowywania. Trwałość można zwiększyć, zamrażając próbki w ciekłym azocie lub w temperaturze rzędu od −70 do −80 °C.

    Ekstrakcja dwufazowa[ | edytuj kod]

    Izolacja RNA za pomocą ekstrakcji dwufazowej i precypitacji

    Po dezintegracji komórek przeprowadza się ekstrakcję RNA roztworem składającym się z fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego w stosunku objętościowym 25:24:1. Powstają dwie fazy – wodna i organiczna. RNA gromadzi się w fazie wodnej. Odczyn fenolu musi być buforowany do odpowiednio kwaśnego poziomu, ponieważ wtedy DNA ulega ekstrakcji do fazy organicznej lub pozostaje w międzyfazie wraz ze zdenaturowanymi białkami. Z wodnej fazy RNA wytrącany jest przez dodanie etanolu lub izopropanolu, po czym mieszaninę wiruje się, a produkt uzyskuje się w postaci niewielkiej ilości zbitego ciała stałego na dnie probówki.

    mRNA, matrycowy (informacyjny, przekaźnikowy) RNA (z ang. messenger RNA) – rodzaj kwasu rybonukleinowego (RNA), którego funkcją jest przenoszenie informacji genetycznej o sekwencji poszczególnych polipeptydów z genów do aparatu translacyjnego.Cytoplazma – część protoplazmy komórki eukariotycznej pozostająca poza jądrem komórkowym a w przypadku, z definicji nie posiadających jądra, komórek prokariotycznych – cała protoplazma.

    Jednostopniowa metoda izolacji RNA (AGPC)[ | edytuj kod]

    Obecne najpopularniejsza metoda izolacji RNA bazuje na ekstrakcji fenolowo-chloroformowej z użyciem soli chaotropowych (np. tiocyjanianu lub chlorowodorku guanidyny). Metoda ta, nazywana AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction), została opracowana w 1987 roku przez Piotra Chomczyńskiego i Nicholettę Sacchi. Praca, w której ta metoda została zaprezentowana, zatytułowana Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction, była według serwisu ScienceWatch najczęściej cytowaną pracą spośród opublikowanych od 1983 do 2002 roku.

    Chlorowodorki - najczęściej chlorowodorki amin (chlorki amoniowe); sole zasady organicznej i kwasu solnego. Chlorowodorki amin są znacznie bardziej odporne na degradację (np. utlenianie) od neutralnych amin i często taka forma jest wykorzystywana do ich przechowywania i handlu. Ponadto chlorowodorki amin są znacznie lepiej rozpuszczalne w wodzie od wyjściowych amin, dzięki czemu leki zawierające ugrupowania aminowe w formie chlorowodorków są łatwo wchłaniane przez organizm pacjenta.Ekson (egzon, sekwencja kodująca) − w komórkach eukariotycznych odcinek genu (zazwyczaj krótszy od intronu), kodujący sekwencję aminokwasów w cząsteczce białka. Eksony bywają w genomie jądrowym oddzielone intronami. Pierwotny transkrypt zawiera wówczas na przemian ułożone odcinki intronowe i eksonowe. Po zsyntetyzowaniu czapeczki i poliadenylacji cząsteczki RNA, ale jeszcze przed jej eksportem z jądra do cytoplazmy następuje wycięcie wszystkich intronów oraz połączenie eksonów w jedną całość (splicing). Po zakończeniu tych procesów transkrypt staje się funkcjonalną cząsteczką informacyjnego RNA (mRNA), który w tej postaci może opuścić jądro komórkowe i zostać użytym w procesie translacji.

    Sole chaotropowe denaturują białka (odbiałczają), ułatwiają rozpad błon komórkowych i są silnym inhibitorem rybonukleaz. W klasycznej metodzie AGPC lizę komórek przeprowadza się w roztworze zawierającym tiocyjanian guanidyny, sarkozyl (detergent), β-merkaptoetanol (usuwa mostki dwusiarczkowe) oraz cytrynian sodu do regulacji pH. Następnie do lizatu dodawane są bufor octanowy o pH 4,0 (złożony z octanu sodu i kwasu octowego), fenol nasycony wodą i mieszanina chloroformu z alkoholem izoamylowym. RNA znajduje się w fazie wodnej i jest następnie wytrącany izopropanolem lub etanolem.

    Biblioteka cDNA (komplementarny DNA) – fragmenty cDNA umieszczonego w komórkach bakteryjnych, np. E. coli. cDNA jest odwzorowaniem mRNA. W komórkach eukariotycznych występują introny które nie występują u prokariotów. Dlatego, aby móc wprowadzić DNA eukariotyczne do bakterii należy usunąć introny. mRNA jest to już sekwencja kodująca, która nie zawiera zbędnych informacji. Należy stworzyć DNA komplementarny do mRNA. Następnie mRNA zostaje odseparowany i nie bierze już udziału w dalszych krokach. Zostaje poddany procesowi degradacji przez RNase H. Przy pomocy primerów syntetyzowana jest druga nić komplementarna do pierwszej. To jest cDNA. Następnie cDNA jest umieszczone w bakterii, gdzie jest powielane.Aldehyd mrówkowy (formaldehyd, nazwa syst.: metanal), HCHO – organiczny związek chemiczny, pierwszy w szeregu homologicznym aldehydów. Został odkryty przez rosyjskiego chemika Aleksandra Butlerowa w 1859.

    Na rynku dostępne są gotowe mieszaniny reagentów (np. TRIzol, TRIsure, TRI Reagent), jak również zestawy z kolumienkami do ekstrakcji RNA, które bazują na powyższych metodach.

    Użycie detergentu Nonidet P-40[ | edytuj kod]

    Cytoplazmatyczny mRNA można wyizolować, stosując niejonowy detergent Nonidet P-40 lub jego zamiennik. Zaletą tej metody jest to, że jądro komórkowe pozostaje nienaruszone, a tym samym istnieje możliwość wyizolowania dodatkowo DNA. RNA zawarte w roztworze można oczyszczać, stosując ekstrakcję fenolowo-chloroformową.

    rRNA – rybosomalny, rybosomowy RNA (z ang. Ribosomal RNA). Cząsteczki kwasu rybonukleinowego wchodzące w skład rybosomów, które biorą udział w procesie biosyntezy polipeptydów.Formamid (amid kwasu mrówkowego, nazwa z łac. formica – mrówka), organiczny związek chemiczny z grupy amidów. Jest to najprostszy amid o wzorze półstrukturalnym: H-(C=O)-NH2.


    Podstrony: 1 [2] [3]




    Warto wiedzieć że... beta

    Otwarty dostęp (OD, ang. Open Access, „OA”) – oznacza wolny, powszechny, trwały i natychmiastowy dostęp dla każdego do cyfrowych form zapisu danych i treści naukowych oraz edukacyjnych.
    Mostek dwusiarczkowy (inaczej mostek disulfidowy) – mostek utworzony przez dwa atomy siarki (-S-S-) dwóch cząsteczek tego samego lub różnych związków chemicznych. Związki zawierające mostki dwusiarczkowe noszą nazwę disulfidów.
    Cytrynian sodu (łac. Natrii citras) – organiczny związek chemiczny, sól sodowa kwasu cytrynowego. Stosowany jako smakowy i konserwujący dodatek do żywności (E331). „Cytrynian sodu” jest nazwą niejednoznaczną, zazwyczaj odnosi się do cytrynianu trisodowego, może jednak dotyczyć soli disodowej lub monosodowej.
    Reagent – łączna nazwa dla substratów i produktów reakcji chemicznej. W nieco innym sensie za reagent uważa się każdą substancję, która po dodaniu do układu reakcji jest w stanie w niej uczestniczyć i wywołać chemiczne efekty.
    PMID (ang. PubMed Identifier, PubMed Unique Identifier) – unikatowy identyfikator przypisany do każdego artykułu naukowego bazy PubMed.
    Izopropanol (propan-2-ol, alkohol izopropylowy), (CH3)2CHOH – organiczny związek chemiczny z grupy alkoholi. Jest najprostszym alkoholem drugorzędowym. Ma jeden izomer podstawnikowy, propan-1-ol.
    Jądro komórkowe, nukleus - otoczone błoną organellum obecne we wszystkich komórkach eukariotycznych, z wyjątkiem tych, które wtórnie je utraciły w trakcie różnicowania, np. dojrzałe erytrocyty ssaków. Zawiera większość materiału genetycznego komórki, zorganizowanego w postaci wielu pojedynczych, długich nici DNA związanych z dużą ilością białek, głównie histonowych, które razem tworzą chromosomy. Geny zlokalizowane w chromosomach stanowią genom komórki. Funkcją jądra komórkowego jest przechowywanie i powielanie informacji genetycznej oraz kontrolowanie czynności komórki, poprzez regulowanie ekspresji genów. Główne struktury, które obecne są w budowie jądra komórkowego to błona jądrowa, podwójna membrana otaczająca całe organellum i oddzielająca je od cytoplazmy oraz blaszka jądrowa, sieć delikatnych włókienek białkowych utworzonych przez laminy, stanowiących rusztowanie dla jądra i nadających mu wytrzymałość mechaniczną. Błona jądrowa jest nieprzepuszczalna dla większości cząsteczek, dlatego obecne są w niej pory jądrowe. Są to kanały przechodzące przez obie błony, umożliwiające transport jonów i innych cząstek. Transport większych cząstek, takich jak białka, jest ściśle kontrolowany i zachodzi na zasadzie transportu aktywnego, kontrolowanego przez białka transportowe. Transport jądrowy jest kluczowy dla funkcjonowania komórki, ponieważ przemieszczanie cząstek poprzez błonę jądrową wymagane jest zarówno przy zarządzaniu ekspresją genów oraz utrzymywaniu chromosomów.

    Reklama

    Czas generowania strony: 0.752 sek.