• Artykuły
  • Forum
  • Ciekawostki
  • Encyklopedia
  • Biblioteka cDNA

    Przeczytaj także...
    Bakteriofag lambda - bakteriofag zawierający dwuniciowy DNA, infekujący bakterie Escherichia coli. Może integrować do genomu gospodarza.Odwrotna transkryptaza, rewertaza, polimeraza DNA zależna od RNA (EC 2.7.7.49) – enzym syntetyzujący nić DNA na matrycy RNA. Proces ten nosi nazwę odwrotnej transkrypcji (por. transkrypcja - przepisywanie z DNA na RNA). Enzym ten wykazuje także aktywność rybonukleazową.
    Wektory plazmidowe – wektory oparte na plazmidach. Dobry wektor tego typu powinien zawierać miejsca rozcinane przez enzymy restrykcyjne, przy czym z reguły dany plazmid posiada kilka takich miejsc dla kilku różnych enzymów. Miejsca te są zwykle zgromadzone w pojedynczym obszarze, zwanym polilinkerem. Żeby wprowadzić obcy DNA do wektora, należy wyciąć żądany fragment (gen) z większej cząsteczki (np. chromosomu lub innego plazmidu) za pomocą enzymu restrykcyjnego, który pozwala na uzyskanie wolnych końców, które można połączyć z wolnymi końcami przeciętego plazmidu. Mogą to być komplementarne lepkie końce lub tępe końce. Obcy DNA łączy się z plazmidem w reakcji prowadzonej przez enzym ligazę.
    Schemat tworzenia biblioteki cDNA

    Biblioteka cDNA – rodzaj biblioteki genowej stanowiącej zbiór kopii mRNA w formie cDNA (komplementarnego DNA) umieszczonych w określonych wektorach.

    Ustalanie sekwencji nukleotydów kodujących określone białko u eukariotów jest utrudnione ze względu na fakt, że tylko około 2% genomowego DNA może kodować białko. Pozostała część to sekwencje regulatorowe, introny, egzony nieulegające translacji, różnego rodzaju niekodujące powtarzające się sekwencje. Analiza DNA związana z kodowaniem białka może być znacznie uproszczona, jeśli podda się jej tylko nieprzerwane kodujące sekwencje. Istotne jest to również, jeśli ekspresję takich sekwencji chce się uzyskać w komórkach bakterii czy drożdży, które same nie mogą usuwać niekodujących fragmentów.

    mRNA, matrycowy (informacyjny, przekaźnikowy) RNA (z ang. messenger RNA) – rodzaj kwasu rybonukleinowego (RNA), którego funkcją jest przenoszenie informacji genetycznej o sekwencji poszczególnych polipeptydów z genów do aparatu translacyjnego.Ekson (egzon, sekwencja kodująca) − w komórkach eukariotycznych odcinek genu (zazwyczaj krótszy od intronu), kodujący sekwencję aminokwasów w cząsteczce białka. Eksony bywają w genomie jądrowym oddzielone intronami. Pierwotny transkrypt zawiera wówczas na przemian ułożone odcinki intronowe i eksonowe. Po zsyntetyzowaniu czapeczki i poliadenylacji cząsteczki RNA, ale jeszcze przed jej eksportem z jądra do cytoplazmy następuje wycięcie wszystkich intronów oraz połączenie eksonów w jedną całość (splicing). Po zakończeniu tych procesów transkrypt staje się funkcjonalną cząsteczką informacyjnego RNA (mRNA), który w tej postaci może opuścić jądro komórkowe i zostać użytym w procesie translacji.

    W przypadku prokariotów na ogół nie tworzy się bibliotek cDNA z ich mRNA, ponieważ jest on niestabilny i prościej można przygotować biblioteki genomowe z wszystkimi sekwencjami genomowymi.

    Zgodnie z centranym dogmatem biologii molekularnej DNA transkrybowany jest na mRNA, które służy jako matryca do syntezy białka. W związku z tym mRNA reprezentuje część genomu ulegającą ekspresji (geny). Ponieważ do żadnego z powszechnie używanych wektorów nie można wprowadzić RNA, na podstawie mRNA syntetyzuje się komplementarne DNA (cDNA).

    Izolacja RNA – proces oczyszczania RNA z innych składników obecnych w komórce. Wyizolowany RNA może zostać użyty m.in. do analizy ekspresji genów, poznania ich budowy (np. lokalizacja egzonów i intronów), kompletowania bibliotek cDNA. Biosynteza białka – proces prowadzący do wytworzenia cząsteczek białka. Proces ten zachodzi we wszystkich żywych komórkach, a także jest możliwy do przeprowadzenia in vitro (pozakomórkowa synteza białka).

    W różnych komórkach czy tkankach ekspresji ulega charakterystyczny zestaw genów (a dodatkowo tę ekspresję można modyfikować), dlatego uzyskane mRNA reprezentuje tylko te geny, które w danej komórce czy tkance są aktywne i tłumaczone na białka.

    Procedura[ | edytuj kod]

    W pierwszym etapie izoluje się RNA danej tkanki czy typu komórek. Następnie oddziela się mRNA, które stanowi tylko 1–5% całkowitego RNA komórki. Wykorzystuje się unikalną cechę mRNA polegającą na występowaniu ogona poli(A) na końcu 3’. Mogą one hybrydyzować (łączyć się) z syntetycznym oligonukleotydem złożonym z deoksytymidyny – oligo(dT). Można więc przykładowo przepuścić preparat RNA przez kolumnę z oligo(dT)-celulozą lub dodać oligo(dT) związany z magnetycznymi kuleczkami do lizatu komórkowego i odłączyć mRNA od reszty mieszaniny za pomocą silnego magnesu.

    Gen (gr. γένος – ród, pochodzenie) – podstawowa jednostka dziedziczności determinująca powstanie jednej cząsteczki białka lub kwasu rybonukleinowego zapisana w sekwencji nukleotydów kwasu deoksyrybonukleinowego.Biblioteka genowa to zbiór różnych sekwencji DNA danego organizmu, które zostały sklonowane w wektorze w celu ich łatwiejszego oczyszczania, przechowywania i analizy. Biblioteki DNA to zestawy klonów DNA (genetycznie odrębny osobnik lub grupa organizmów identycznych genetycznie). Każdy z klonów powstał poprzez włączenie do wektora innego fragmentu DNA, który następnie został namnożony w komórkach gospodarza. Do skonstruowania biblioteki genowej wykorzystuje się komórki bakteryjne.

    Następnie sprawdza się, czy mRNA nie uległ degradacji. Można wykorzystać w tym celu bezkomórkowe systemy translacji (np. lizat retikulocytów królika) lub elektroforezę żelową. Do syntezy cDNA na matrycy mRNA wykorzystywany jest enzym odwrotna transkryptaza. Wymaga to startera, którym zwykle jest oligo(dT). Do syntezy drugiej nici, po zniszczeniu nici mRNA przez hydrolizę alkaliczną, można jako starter zastosować oligo(dG). Zwykle dokonuje się również obróbki końców cDNA, aby uzyskać lepkie końce ułatwiające wprowadzenie go do wektora.

    Para zasad (pz lub bp z (ang.) base pair) - w biologii molekularnej - komplementarne, połączone wiązaniami wodorowymi zasady azotowe nukleotydów dwóch różnych nici kwasu nukleinowego. W parach zasad podaje się długość cząsteczek DNA.Genom – materiał genetyczny zawarty w podstawowym (haploidalnym) zespole chromosomów. Termin mylony jest z genotypem, czyli całością informacji genetycznej zawartej w chromosomach organizmu.

    cDNA są stosunkowo krótkie (0,5–10 kpz), dlatego do klonowania często stosuje się wektory plazmidowe. Do uzyskania dużej liczby klonów stosowane są również wektory pochodne faga λ, głównie do konstruowania ekspresyjnych bibliotek cDNA. Są to biblioteki zaprojektowane w taki sposób, aby zoptymalizować ekspresję wprowadzonego fragmentu DNA.

    Hybrydyzacja kwasów nukleinowych – zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów nukleinowych (DNA z DNA, RNA z RNA lub DNA z RNA). Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają rozdzieleniu (tzw. denaturacji) pod wpływem wysokiej temperatury lub substancji chemicznych, takich jak formamid lub mocznik. Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego, nici łączą się ponownie (renaturacja). Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji.Bakterie (łac. bacteria, od gr. bakterion – pałeczka) – grupa mikroorganizmów, stanowiących osobne królestwo. Są to jednokomórkowce lub zespoły komórek o budowie prokariotycznej. Badaniem bakterii zajmuje się bakteriologia, gałąź mikrobiologii.

    Przypisy[ | edytuj kod]

    1. Hildebrandt i Igarashi 1999 ↓, s. 273–274.
    2. Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P.: Podstawy Biologii Komórki cz. 1. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2016, s. 346. ISBN 978-83-01-14468-5.
    3. Turner P., McLennan A., Bates A., White M.: Krótkie Wykłady. Biologia Molekularna. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2007, s. 172–175. ISBN 978-83-01-14146-2.
    4. Hildebrandt i Igarashi 1999 ↓, s. 282.

    Bibliografia[ | edytuj kod]

  • Onuchic L. F., Germino G. G.: cDNA Libraries. W: F. Hildebrandt, P. Igarashi: Techniques in Molecular Medicine. Springer, 1999. DOI: 10.1007/978-3-642-59811-1. ISBN 978-3-642-47808-6.
  • Centralny dogmat biologii molekularnej – hipoteza według której przepływ informacji genetycznej następuje od DNA poprzez RNA do białka. Hipoteza ta została sformułowana przez Francisa Cricka na corocznym spotkaniu Towarzystwa Biologii Eksperymentalnej w 1957 rokuWektor genetyczny – wykorzystywana powszechnie w inżynierii genetycznej, niewielka cząsteczka DNA (taka jak plazmid czy DNA wirusów), służąca wprowadzeniu żądanej sekwencji DNA do komórki. Stosując odpowiednie wektory można spowodować wydajną ekspresję genów w nich zawartych (wektory ekspresyjne) lub integrację sekwencji przenoszonej na wektorze do genomu biorcy (np. wektory retrowirusowe), jak również przeprowadzić klonowanie genu (wektor klonujący). Takie wektory służą do wprowadzania obcego DNA do komórek i utrzymywania go w kolejnych podziałach komórkowych. Istnieją także wektory bifunkcjonalne (wahadłowe), które mogą egzystować w co najmniej dwóch odmiennych organizmach (np: w drożdżach i bakteriach).




    Warto wiedzieć że... beta

    Prokarionty, prokarioty, organizmy prokariotyczne (Prokaryota, Procaryota) – mikroorganizmy w większości jednokomórkowe, których komórka nie zawiera jądra komórkowego oraz organelli komórkowych charakterystycznych dla eukariontów. Nazwa pochodzi od greckich słów pros ("przed") i karyon ("orzech", "jądro"). Pozostałe synonimy to: akariobionty, akariota, organizmy akariotyczne, anukleobionty, bezjądrowce, bezjądrowe, prokariota, protokarionty, przedjądrowce.
    Kwasy rybonukleinowe, RNA – organiczne związki chemiczne z grupy kwasów nukleinowych, zbudowane z rybonukleotydów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi. Z chemicznego punktu widzenia są polimerami kondensacyjnymi rybonukleotydów. Występują w jądrach komórkowych i cytoplazmie, często wchodząc w skład nukleoprotein. Znanych jest wiele klas kwasów rybonukleinowych o zróżnicowanej wielkości i strukturze, pełniących rozmaite funkcje biologiczne. Zarówno struktura, jak i funkcja RNA jest silnie uzależniona od sekwencji nukleotydów, z których zbudowana jest dana cząsteczka.
    Splicing, składanie genu, wycinanie intronów – usunięcie intronów (sekwencji niekodujących) i połączenie eksonów (sekwencji kodujących) z prekursorowego mRNA organizmów eukariotycznych. Proces ten zachodzi podczas obróbki posttranskrypcyjnej po to, by dojrzały mRNA, przygotowany do translacji, kodował ciągły łańcuch polipeptydowy (od kodonu start do stop). Splicing katalizowany jest przez kompleks białek i RNA zwany spliceosomem. W niektórych przypadkach następuje samowycinanie się intronów, bez udziału spliceosomu, funkcję katalityczną pełni wówczas RNA (rybozym).
    Koniec lepki, koniec kohezyjny – kilkunukleotydowy jednoniciowy odcinek DNA znajdujący się na końcu dwuniciowego DNA.
    Koniec 3′ (czytaj: „koniec trzy prim”) – koniec nici kwasu nukleinowego (DNA lub RNA), jeden z jej skrajnych nukleotydów.
    Drożdże (Saccharomyces Meyen ex E.C. Hansen) – rodzaj grzybów jednokomórkowych z rodziny drożdżakowatych (Saccharomycetaceae).
    Biblioteka genomowa (też: bank genów, bank genomowy) – to kolekcja klonów (zazwyczaj bakterii), która jako całość zawiera co najmniej jedną kopię każdej sekwencji DNA obecnej w genomie organizmu, którego bibliotekę genomową utworzono.

    Reklama

    Czas generowania strony: 0.015 sek.